CRISPR/Cas13-vermittelte antivirale Therapie gegen SARS-CoV-2 und seine Varianten: eine neuartige Technologie zur Bekämpfung des viralen Genoms
Projektleiterin: Prof. Dr. med. Elisabeth Zeisberg
Schlüsselbereich
- Antivirale Strategien: Wirk- und Impfstoffe, Antikörper
Wer war beteiligt?
- Prof. Dr. med. Elisabeth Zeisberg (Projektleiterin, UMG)
- Prof. Dr. med. Michael Zeisberg (UMG)
- Prof. Dr. med. Gerd Hasenfuß (UMG)
- PD Dr. Xingbo Xu (UMG)
- Prof. Dr. Stefan Pöhlmann (DPZ)
- Prof. Dr. Rabea Hinkel (DPZ)
- Prof. Dr. Dr. Albert Osterhaus (TiHo)
Was war das Ziel?
Wir haben ein CRISPR/Cas13-System entwickelt, welches aus CRISPR/Cas13 und verschiedenen gegen SARS-CoV-2 gerichtete crRNAs besteht und so das virale Genom und mRNA zerstört. Mittels adeno-assoziierte Viren (AAV) als Vehikel führt das System in der Zellkultur zu einer mehr als 99%igen Reduktion der Infektiosität von SARS-CoV-2. Im Rahmen von COFONI sollen nun die Wirksamkeit verschiedener Kombinationen an crRNAs gegen SARS-CoV-2 im Hamstermodell, das therapeutische Zeitfenster sowie die Sicherheit und die Effektivität gegen andere Varianten untersucht werden.
Das wurde erreicht:
Die COVID-19-Pandemie führte weltweit zu über 700 Millionen Infektionsfällen und mehr als 7 Millionen Todesfällen. Im Mai 2023 erklärte die WHO die Pandemie offiziell für beendet. COVID-19 wird durch das Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht, ein einzelsträngiges Positivstrang-RNA-Virus aus der Familie der Coronaviridae. Das CRISPR/Cas-System dient Bakterien und Archaeen als adaptiver Abwehrmechanismus gegen Phagen und fremde Nukleinsäuren. Während Cas9 primär für DNA-Editing eingesetzt wird, zeichnet sich Cas13 durch seine Fähigkeit aus, RNA sequenzspezifisch zu erkennen und zu spalten. Die Zielsteuerung erfolgt über kurze CRISPR-RNAs (crRNAs), die das Enzym zu komplementären RNA-Sequenzen leiten. Trotz verfügbarer Impfstoffe besteht weiterhin Bedarf an flexiblen antiviralen Strategien, die unabhängig von Spike-Mutationen wirken. CRISPR/Cas13 stellt eine modulare Plattform dar, die einerseits eine gesamte Virusfamilie inklusive möglicher Varianten abdeckt. Ziel des Projekts war die Entwicklung und präklinische Evaluation einer CRISPR/Cas13-basierten antiviralen Therapie gegen SARS-CoV-2. Es wurde ein CRISPR/Cas13d-System etabliert, bestehend aus Cas13d und mehreren gegen konservierte Regionen des SARS-CoV-2-Genoms gerichteten crRNAs. Unter Verwendung AAV-2 als Vektor wurde in Zellkultur eine Reduktion der SARS-CoV-2-Infektiosität von über 99 % erzielt. Die antivirale Wirksamkeit wurde ebenfalls gegen die VOCs Omicron BA.1 und XBB1.5 untersucht. Die ausgewählten crRNAs reduzierten die Infektiosität dieser Varianten dosisabhängig um bis zu 80 %. Der Immunogenität von Cas13d wurden in vitro getestet. Ziel war die Identifikation von Peptiden, die nach Cas13-Expression über den MHC-Komplex präsentiert werden. Die Probenanalyse erfolgte mittels Massenspektrometrie und konnten insgesamt 23 Cas13d-spezifische Peptide identifiziert werden. Parallel wurde eine In-silico-Vorhersage potenziell immunogener Epitope durchgeführt. Die fünf höchstbewerteten Peptide wurden für weiterführende Analysen ausgewählt. Insgesamt wurden 26 Peptide synthetisiert und funktionell getestet. Keines der identifizierten Peptide induzierte nach Stimulation humaner PBMCs IFN-γ-, IL-2- oder TNF-Produktion in CD8⁺-T-Zellen. Es ist jedoch bekannt, dass das vollständige Cas13-Protein eine Immunantwort auslösen kann. Die Ergebnisse belegen das Potenzial von CRISPR/Cas13d als flexible antivirale Plattformtechnologie. Durch den modularen Austausch der crRNAs ist eine rasche Anpassung an neue RNA-Virusfamilien inklusive möglicher Varianten abdeckt. Es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um die immundominanten Peptide innerhalb des Proteins zu identifizieren.